| Научный журнал
 АНАЛИЗ СТАБИЛЬНОСТИ КОМПОНЕНТОВ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА С (НА ОСНОВЕ СКОНСТРУИРОВАННЫХ ДНК-БИОЧИПОВ) | статьи | Научный журнал

АНАЛИЗ СТАБИЛЬНОСТИ КОМПОНЕНТОВ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА С (НА ОСНОВЕ СКОНСТРУИРОВАННЫХ ДНК-БИОЧИПОВ)

Опубликовано: 04-07-2014
Автор(ы): Г.А.Шопаева1, И.А.Пышная2, Е.В.Дмитриенко2, В.Ф.Зарытова2, Д.В.Пышный2, Ш.А.Бейсембаева1, Д.А. Кушенова3 1Казахский национальный медицинский университет им.С.Д.Асфендиярова, г.Алматы, Казах-стан; 2Институт химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) СО РАН, г.Новосибирск, Россия; 3Городская инфекционная клиническая больница, г.Алматы, Казахстан

По данным ВОЗ в мире более 500 миллионов человек инфицированы вирусом гепатита С (НСV). Это число ежедневно увеличивается, в основном за счет вовлечения в эпидемический процесс лиц молодого возраста, употребляющих наркотические вещества внутривенно. В разных странах от 1 до 5% населения поражены этим вирусом.

Специфическая лабораторная диагностика HCV-инфекции основана на обнаружении специфических антител к основным антигенам вируса (иммуноферментный анализ - ИФА) и определении РНК вируса, его количества и генотипа. Иммуноферментные тест-системы третьего поколения для определения антител к HCV, где в качестве связывающего антигена на твердой фазе используются иммунореактивные синтетические пептиды, являются достаточно чувствительными и информативными, а их широкое использование повысило процент выявления лиц, инфицированных вирусом гепатита С.

В отличие от ИФА, методы генодиагностики относятся к прямым методам обнаружения возбудителя в клиническом материале, что позволяет оценить активность вирусного процесса и проследить процессы распространения возбудителя в различных органах и тканях. В лабораторной диагностике вирусных гепатитов методам выявления и идентификации вирусной ДНК/РНК отводится особое место в виду невозможности культивирования этих возбудителей in vitro. Известно, что эффективность лечения и прогноз HCV-инфекции зависят от генотипа вируса [1].

В ИХБФМ была создана тест-система для генотипирования вируса гепатита С в биочиповом варианте. Разработка данной тест-системы основана на обратной гибридизации иммобилизованного на твердофазный носитель HCV-специфичного олигонуклеотидного зонда с высококонсервативным участком кДНК HCV [2]. В процессе разработки были показаны ее высокие аналитические характеристики. Тест-система была успешно использована для выявления и генотипирования вируса гепатита С в клинических образцах, полученных от пациентов, проживающих в России. Апробация тест-системы сотрудниками КазНМУ им.С.Д.Асфендиярова в Казахстане продемонстрировала, что данная тест-система может применяться на территории Казахстана для выявления HCV и генотипирования шести наиболее распространенных субтипов вируса (1a,1b,2a,2b,3a,3b).

Немаловажным фактором качественного проведения любого лабораторного анализа является соблюдение условий хранения и транспортировки реактивов и тест-систем.

Разработанная в ИХБФМ СО РАН тест-система на выявление и генотипирование ВГС предусматривает определенные температурные режимы хранения, а именно: ДНК-чип, буферные и промывочные растворы хранятся при +4 оС, ферменты – при -20оС.

Однако, при транспортировке и передаче тест-системы возможны перепады и нарушение температурного режима хранения, которые могут негативно отражаться на качестве получаемого сигнала гибридизационного анализа. Особенно следует обратить внимание на работу ферментов, для контроля активности которых в процессе разработки тест-системы были проработаны соответствующие точки на ДНК-чипе (рисунок 1, контроли 1К+ и 2К+).

Цель: проверить устойчивость компонентов тест-системы для генотипирования вируса гепатита С (на основе сконструированных ДНК-биочипов) при неблагоприятных условиях температурного и временного режимов хранения.

Материалы и методы: Для реализации поставленной цели нами были проведены три серии экспериментов.

В первых двух экспериментах все компоненты тест-системы были выдержаны:

В эксперименте №1 -  в течение 2 недель при +4 оС;

В эксперименте №2 – в течение 24 часов при температуре +40 оС.

В эксперименте №3 при комнатной температуре в течение восьми месяцев был выдержан только ДНК-чип тест-системы. 

По окончании сроков хранения были проведены стандартные процедуры постановки гибридизационного анализа, промывочные этапы и процедуры выявления [1].

Результаты и обсуждение. Интенсивность сигнала анализа для каждой из вышеописанных тест-систем сравнивали с интенсивностью сигнала свежеприготовленной контрольной тест-системы К, условия хранения которой были полностью соблюдены. На рисунках 1 и 2 представлены соответствующие сканированные изображения капроновых мембран ДНК-чипов после проведения экспериментов в условиях различных режимов температурного и временного хранения.

Рисунок 1. Сканированные изображения ДНК-чипов после выдерживания тест-систем при +4оС (№1) и +40оС (№2). К – контрольный  ДНК-чип, условия хранения которого были полностью соблюдены. В качестве матрицы использован ПЦР-фрагмент, соответствующий генотипу 1b.

Только в случае эксперимента №2 (+40оС) наблюдается некоторое падение интенсивности, что может быть объяснено снижением активности ферментов. Однако, в общем, из представленных данных видно, что интенсивность сигналов тест-систем для зондов в присутствии соответствующей правильной матрицы 1b сравним с интенсивностью сигнала контрольной тест-системы К(-20оС), условия хранения которой были полностью соблюдены.

В случае эксперимента №3 интенсивность сигнала не отличается от интенсивности контроля даже после восьми месяцев хранения ДНК-хранения (при комнатной температуре).

Таким образом, установлено, что все компоненты испытуемой тест-системы на основе ДНК-биочипов для детекции и генотипирования вируса гепатита С выдерживают изменения температурного режима и временных сроков хранения. 

Рисунок 2. Сканированные изображения ДНК-чипов после восьмимесячного выдерживания тест-систем при  комнатной температуре (№1). К – контрольный  ДНК-чип, условия хранения которого были полностью соблюдены. В качестве матрицы использован ПЦР-фрагмент, соответствующий генотипу 1b.

Литература:

  1. Feld J.J., Hoofnagle J.H. Mechanism of action of interferon and ribavirin in treatment of hepatitis C. //Nature, 2005.-436 (7053).- P.967-972.
  2. Зарытова В.Ф., Пышная И.Л., Пышный Д.В., Филиппенко М.Л., Иванова Е.М. Уникальные тест-системы для выявления и генотипирования вируса гепатита С. // III международная конференция «Высокие технологии в XXI веке», 31 октября – 7 ноября 2004 г., г.Бенидорм, Испания, С.35-36.

 

 

год: 2010 выпуск №1